重庆医科大学 第四届“构想杯”创新实验设计大赛
项目申请书
项目名称：
糖尿病与睡眠障碍的相关性以及相关度，
同时分析相关危险因素
指导老师：
申
请
者：
王补云
专业年级：5 2015 级临床医学
联系电话：
13896883614
申请日期
：7 2017 年 年 0 10 月 月 4 24 日 日 研究项目
项目名称
糖尿病与睡眠障碍的相关性以及相关度，同时分析相关危险因素
所属学科
内科学
项目小组成员
姓名
性别
学办
专业年级
手机
学号
签名
王补云
女
一
15 临床
13896883614
2015220900
刘妍伶
女
四
16 护理
18723712799
2016220712
刘雨露
女
四
16 护理
18323415515
2016220714
曾子桓
女
四
16 护理
15330341393
2016220811
余秋华
女
四
17 护理
18290257902
2017222517
指导老师
项目摘要(400~500字)
睡眠障碍包括睡眠不全和睡眠破裂，是指睡眠量，质或定时异常，或者是在睡眠中或睡眠一觉醒来时发生异常行为或生理事件。几项大型前瞻性研究表明，这些睡眠障碍与葡萄糖代谢异常和糖尿病风险增加有关。睡眠障碍或睡眠质量差可能对血糖调节产生负面影响，引起糖耐量减低和胰岛素敏感性下降，从而加重 2 型糖尿病的发展的严重程度。
此外，相关动物模型的研究已经把昼夜节律系统的破坏作为不良代谢结果的推定风险因素。睡眠障碍可由调节睡眠觉醒的内部机制异常引起，也可以由躯体疾病引起，因此，疾病和睡眠对于人体健康的影响不是单向的，而是双向的。同时研究发现睡眠昼夜调节在调节胰岛素的产生、胰岛素敏感性以及葡萄糖利用中发挥巨大作用 ，当机体因为各种原因出现睡眠障碍，可能继发导致代谢综合征、胰岛素抵抗、血糖代谢异常等一系列问题。
现就睡眠障碍对糖尿病的影响进行分析，并探讨睡眠障碍可能导致的代谢指标的变化，通过设计小鼠慢性睡眠限制实验，发现其中的相关危险因素与糖尿病发展调控相关。
本次实验可以为临床上优化睡眠和昼夜节律功能作为预防或治疗糖尿病的新型行为干预措施提供参考依据。
一、立论依据
2型糖尿病(T2DM)对人群的健康影响巨大，糖尿病患者随着病程的延长往往出现睡眠障碍，但尚未引起临床的足够重视，研究发现糖尿病患者睡眠障碍发生率较高，往往两者互为因果、相互影响，形成恶性循环[1] 。
与大多数哺乳动物不同，人类的睡眠一般被合并成一个单一的7～9h 的过程，在睡眠期间，胰岛β细胞的反应性和胰岛素敏感性会受到睡眠昼夜调节的影响，同时葡萄糖耐受性和动态平衡也会受其调控[2] 。机体中葡萄糖水平的调节依赖于葡萄糖产生和消耗之间的平衡。血糖主要由肝脏产生，并被胰岛素依赖性组织(肌肉和脂肪等)和胰岛素非依赖性组织(大脑)所利用[3] 。因此血糖稳态既依赖于胰腺β细胞精准地释放胰岛素，又需要胰岛素充分地发挥作用。而睡眠障碍会影响胰岛素的释放和敏感性，以及对机体多种激素的调节，从而会使糖尿病风险增加，故糖尿病性睡眠障碍对机体影响巨大，主要表现在以下两方面：一方面，睡眠障碍会促进下丘脑-垂体-肾上腺素皮质系统释放较多糖皮质激素，导致葡萄糖产生增加、利用减少，最终影响血糖控制；另一方面，夜间胰高血糖素、儿茶酚胺、皮质醇等胰岛抵抗性激素可因睡眠障碍而发生神经生化改变，导致胰岛素敏感性降低，血糖稳态发生改变，促使并发症的发生，加重2型糖尿病的发展[4] 。
此外，研究者在大鼠模型中发现，随着睡眠剥夺时间的延长，大鼠血清促肾上腺皮质激素(ACTH)表达水平首先呈升高的趋势，并在睡眠剥夺的第3
天达到最高值，之后呈明显下降趋势，而血清中皮质醇水平也随之呈现逐渐升高的趋势，并于睡眠剥夺后第5天达到最高值，之后逐渐下降，该研究明确证实了睡眠不足对 FC 的影响，因此睡眠障碍患者血浆皮质醇水平升高可能是引发糖尿病的病理生理机制之一[5] 。众所周知糖皮质激素能够在多个胰岛素作用的靶点上影响胰岛素敏感性，还能直接抑制胰岛β细胞分泌胰岛素[6] 。在早期，糖皮质激素能损坏跨膜葡萄糖转运子4(GLUT-4)的能力，使得葡萄糖无法转运至细胞表面被机体所利用[7] 。还有研究证实，糖皮质激素能够阻碍骨骼肌合成糖原，降低葡萄糖利用率和胰岛素受体亲和力[8] 。
大量的流行病学研究表明，睡眠短暂或中断，慢性睡眠剥夺可能加速2型糖尿病发病及相关病症的严重程度,会使糖尿病发生风险增加[9] 。然而，在动物研究中，睡眠限制导致体重增加的衰减，这种现象不能通过能量摄入的变化来解释。睡眠受限的大鼠体重增加的衰减是由能量消耗的总体增加以及不变的能量摄入量来解释的。在大多数研究中，老鼠长时间遭受慢性睡眠剥夺，不像现代人类睡眠限制，其特点是每天有睡眠的机会[10] 。最近对啮齿动物的研究模拟了人类睡眠限制，测量其对代谢率的影响，研究结果表明，与完全睡眠剥夺不同，睡眠限制（每日睡眠机会）会增加体重，这与人的状况最相似[11] 。
慢性睡眠削弱作为外源性压力因素，已经成为常见问题，已被证明与2型糖尿病有关。国外有研究者使用慢性睡眠限制模型，来模拟人类在现代社会
中的日常生活，结果表明慢性睡眠障碍改变了大鼠胰岛素分泌的脂肪酸代谢和胰岛素分泌功能。慢性睡眠限制对胰岛功能障碍的影响是基于循环FFAs 的减少和胰岛素颗粒的对接减少。在增加膳食脂肪的同时，部分 CSR大鼠恢复了胰岛的胰岛素分泌[12] [11]。研究结果揭示了睡眠损失引起胰岛功能障碍的机制并强调循环 FFAs 的重要性。
通过以上叙述，我们可以知道睡眠障碍可以影响糖尿病的多种相关指标。但是值得注意的是，国内外使用动物模型研究昼夜节律紊乱的代谢后果，很少控制睡眠持续时间或质量。而且，绝大多数临床糖尿病研究忽视了睡眠时间，睡眠质量，OSA 和昼夜节律的存在，是对糖尿病风险和严重程度预测混杂的因素[13] 。关于糖尿病预防或治疗的临床试验应评估习惯性睡眠持续时间和质量，以及接触昼夜节律的干扰物[14] 。
本实验通过查找并分析现有文献，通过控制不同的睡眠干扰时间，从而具体量化研究睡眠持续时间及睡眠质量对糖尿病相关危险因素的影响，以明确实验过程中发生变化的指标在糖尿病发生过程中的作用，来判断其能否作为预防和治疗糖尿病切入的关键点。
参考文献：
[1] 张鹏,蒋兰兰,罗勇,许向红,袁璐,马建华. 2型糖尿病伴睡眠
障碍患者血糖波动与胰岛功能的相关性分析[J]. 安徽医药,2016,v.2004:756-757.
[2] 朱冰倩,李小妹,鱼星锋. 2型糖尿病患者睡眠质量及其对血糖控制的影响[J]. 中华护理杂志,2014,v.4909:1125-1129.
[3] 李佳琦,严悦蓉,余叶蓉. 睡眠障碍与糖尿病的关系及其对糖代谢的影响研究进展[J]. 中国全科医学,2017,v.20;No.53011:1300-1304.
[4] 马巧琳,胡斌,高希言. 睡眠障碍动物实验指标选取状况及分析[J]. 中国中医基础医学杂志,2005,(05):385-387.
[5] Nedeltcheva, A. V. and F. A. Scheer(2014). "Metabolic effects of sleep disruption, links to obesity and diabetes." Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 21(4): 293-8.
[6] Barclay, J. L. and J. Husse, et al. (2012). "Circadian desynchrony promotes metabolic disruption in a mouse model of shiftwork." PLoS One 7 7(5): e37150.
[7] Mavanji, V. and C. J. Billington, et al. (2012). "Sleep and obesity: a focus on animal models." Neurosci Biobehav Rev 36(3): 1015-29.
[8] Barf, R. P. and G. Van Dijk, et al. (2012). "Metabolic consequences of chronic sleep restriction in rats: changes in body weight regulation and energy expenditure." Physiol Behav 107(3): 322-8.
[9] Arble, D. M. and J. Bass, et al. (2015). "Impact of Sleep and Circadian Disruption on Energy Balance and Diabetes: A Summary of Workshop Discussions." Sleep 38(12): 1849-60
[10] Reutrakul, S. and E. Van Cauter(2014). "Interactions between sleep, circadian function, and glucose metabolism: implications for risk and severity of diabetes." Ann N Y Acad Sci 1311: 151-73.
[11] Zhan, S. and Y. Wu, et al. (2016). "Decrease in Circulating Fatty Acids Is Associated with Islet Dysfunction in Chronically Sleep-Restricted Rats." Int J Mol Sci 17(12).
[12] Gale, J. E. and H. I. Cox, et al. (2011). "Disruption of circadian rhythms accelerates development of diabetes through pancreatic beta-cell loss and dysfunction." J Biol Rhythms 26(5): 423-33.
[13] Depner, C. M. and E. R. Stothard, et al. (2014). "Metabolic consequences of sleep and circadian disorders." Curr Diab Rep 14(7): 507.
[14] Cho, E. H. and H. Lee, et al. (2014). "Sleep disturbances and glucoregulation in patients with type 2 diabetes." J Korean Med Sci 29(2): 243-7.
二、研究方案
1. 设计思路
本实验通过制作小鼠水模型，使用平台诱导慢性睡眠限制干扰小鼠的睡眠。由于睡眠导致机体内代谢因子、胰岛素耐受和葡萄糖耐受发生变化，在实验阶段及时的检测这种变化，记录相关数据，并作出时间-浓度曲线，为实验结果分析提供参考依据。
2. 研究技术路线和研究内容
技术路线
本实验主要探究小鼠体内血糖、胰岛素等影响糖尿病的因素在小鼠失去稳定睡眠后的指标变化，以及这种变化对小鼠是否易发糖尿病造成影响。首先对小鼠设立不同的睡眠干扰时间，在对其进行睡眠干扰后，测定其体重、代谢因子、ITT 和 GTT。
研究内容
观察受到睡眠干扰后的小鼠体内血糖、胰岛素等指标随干扰时间梯度不同而变化，探究睡眠障碍与糖尿病相关危险因素指标的联系。具体实验方案如下：
【研究对象】
大鼠
【实验材料】
实验材料
来源
金属笼、代谢笼（23cm*23cm*35cm）
圆形平台两个（r=4.5cm，h=5cm）（r=15cm，h=5cm）
饲料杯
重庆医科大学实验动物中心
ELISA 试剂盒
上海科顺生物科技有限公司
生化试剂盒
上海索宝生物有限公司
葡萄糖（2g/Kg）
重庆医科大学实验动物中心
胰岛素（1U/Kg）
诺和灵
【实验方法】
(1) 建立睡眠干扰的水模型
将大鼠分为 4 组，1 组不进行睡眠干扰，2、3、4 组分别在水模型中进行睡眠干扰 4、8、12 小时。在充满水的金属笼（23cm×23cm×35cm）中，将放置在不能旋转的圆形平台（直径 4.5cm，高 5cm）上。平台比水高 1 厘米。肌肉酸痛导致大鼠掉入水中唤醒。将对照的 1 组大鼠置于含有圆形平台（直径 15cm，高 5cm）的笼子中，不含水，并保持在与其他组大鼠相同的实验环境中。
(2) 代谢因子的测定
每两天测量体重。通过从前几天的重量减去饲料杯的重量来测量食物摄取量。使用血糖计测量血糖水平。使用代谢笼测量热量产生和呼吸交换比例。1 小时内立即收集血清样品，用 ELISA 试剂盒测定血清皮质酮浓度。用生化试剂盒评估循环总胆固醇，甘油三酯，HDL 胆固醇和游离脂肪酸。
(3) 葡萄糖耐量试验（GTT）和腹膜内胰岛素耐量试验（ITT）
GTT:小鼠葡萄糖耐受实验的葡萄糖用量一般为 1.5-2g/kg，如葡萄糖 2 g/kg，用生理盐水配制 20%葡萄糖溶液。（1g/kg，0、15、45、75、105min测血糖，10%葡萄糖注射液，注射量 0.1mg/10g 体重。)
前一天下午 5 点禁食，16h 即次日上午 9 点，饮水正常。注射前测血糖，腹腔注射葡萄糖，每 g 注射 0.01ml，每只间隔 1min，在 15min、30min、60min、90min、120min 分别测血糖，实验完毕，每笼补充上饲料。
ITT：胰岛素用量根据小鼠的年龄和性别来决定，一般理想用量是使葡萄糖水平在注射 30min 后下降至注射前的 40%左右。小鼠胰岛素耐受实验的胰岛素用量一般为 0.5-1.2U/kg，胰岛素用生理盐水稀释，如用量 0.5U/kg，配制浓度 0.5U/ml。（0.75U/kg，0、15、30、60min 测血糖；0.027U/10g=2.7U/kg。）
在禁食 4 小时后正常饮水。进行试验，称体重，标记序号，注射胰
岛素前测血糖，胰岛素按体重计算注射量，在 15min、30min、45min、60min 分别测血糖记录，实验完毕，每笼补充上饲料。
（4）结果记录并进行统计学分析
3. 可行性和创新性
可行性分析
(1) 本课题组借助的材料和器材较为方便研究，经费投资较少。
(2) 重庆医科大学基础医学院及创新实验室，具备完成该实验的场地和设备实验器材。此外实验药品易于购买，实验动物可由重庆医科大学实验动物中心提供。
(3) 我们团队成员在平时的实验课程中学习并掌握了一定的实验操作方法，并且通过阅读大量已有的文献，明确实验相关反应的原理，熟悉对实验观察和研究的相关操作。
(4) 本实验设置的变量为不同的睡眠干扰时间，其易于控制，并且实验相关指标检测原理不复杂，其中的关键实验技术都已成熟可靠，当前学校实验室可以实现，具有可操作性强的特点。
创新型分析
(1) 目前尚无实验研究睡眠持续时间和睡眠质量影响糖尿病的程度，本实验正是以此为切入口研究糖尿病相关代谢指标在不同睡眠干扰时间下的变化。
(2) 在国内外较少实验针对研究糖尿病与睡眠障碍的相关性和相关度，只是说存在影响，并没有过多深入研究探讨睡眠持续时间与糖尿病指标变化的联系。所以本次实验通过不同程度，不同时间段，不同梯度对大鼠的睡眠干扰，观察多个代谢因子对糖尿病的影响量效与时效关系，探究影响糖尿病严重程度的相应指标的变化。
(3) 通过查找阅读文献后发现，本实验设计与近期国内外相关研究没有较大范围的重复，具有其独特的创新性，相信实验结果可以为临床上具体量化改善糖尿病人睡眠时间提供较为有效的参考。
4. 预期研究结果
慢性睡眠限制小鼠与对照组相比，其胰岛素敏感性、葡萄糖耐量及其他指标会有不同变化，并且睡眠干扰不同时间梯度的小鼠指标变化不同。通过实验数据及统计学分析，我们可以发现睡眠障碍与糖尿病相关指标
的联系，从而明确睡眠障碍对糖尿病发生发展影响最密切的因素，从而为糖尿病的治疗和预防提供参考依据。
三 、经费预算
支 出 科 目
金
额
用
途
实验材料费 500
培养器材等实验耗材
实验动物费 600
大鼠乳鼠（40 只）
药
品
1 900
ELISA 试剂盒
2 120（单价）
生化试剂盒
3 38
葡萄糖（2g/Kg）（50 支共计 1 升）
4 65（单价）
胰岛素（1U/Kg）
5
20
注射器
其他
无
合计
2243